实验室常用的
多肽纯化填料包括反相色谱填料、离子交换填料（阳离子/阴离子交换树脂）及亲和填料（如镍柱、肝素柱），其使用需兼顾原理认知与操作细节，同时规避常见误区。本文将系统梳理常用多肽纯化填料的使用技巧，并指出实验操作中的常见误区，帮助科研人员提升纯化成功率。
常用填料类型与适用场景
反相色谱填料是常用的多肽纯化介质，特别适用于中小型疏水性多肽的纯化。疏水性较强的多肽（如含芳香族氨基酸）通常选用C18，而较大分子量或疏水性较弱的多肽则更适合C4或C8。离子交换填料（阳离子/阴离子）则适合带电荷多肽的纯化，通常在特定pH条件下使用，能有效分离电荷差异的多肽。
核心使用技巧
1.填料预处理与平衡
新填料或长期未使用的填料需充分预处理。反相填料先用甲醇润洗活化，再过渡到初始流动相；离子交换填料则需用高离子强度溶液洗去杂质，再用起始缓冲液平衡。常见的错误是平衡不充分，导致保留时间不稳定，分离效果差。
2.样品处理优化
溶解多肽样品时，应选择与起始流动相兼容的溶剂。对于反相色谱，若样品溶解困难，可加入少量甲酸或乙腈助溶，但需控制比例，避免过早洗脱。离子交换色谱中，样品离子强度应低于起始缓冲液。
3.梯度条件优化
梯度洗脱是多肽纯化的关键。初始有机相比例应使目标多肽保留在柱上，而梯度斜率（通常每分钟0.5%-2%有机相变化）需根据多肽疏水性调整。陡峭梯度适合简单体系，平缓梯度则能提高难分离多肽的分辨率。避免梯度变化过快导致共洗脱，或过慢造成峰展宽。
4.流动相选择
反相色谱中，水-乙腈或水-甲醇体系最为常见，添加0.1%（TFA）可改善峰形并抑制硅羟基作用。对于碱性多肽，可改用甲酸或乙酸体系以减少拖尾。离子交换色谱需精确控制缓冲液的pH和离子强度，以确保稳定的电荷状态。
5.流速与温度控制
对于分析型柱（内径4.6mm），流速通常为0.5-1.0mL/min；制备型柱则根据内径平方比例放大。适当提高柱温（30-40℃）可降低背压并改善传质，但需注意多肽的热稳定性。
常见误区与规避策略
误区一：忽视填料再生与保存
长期使用后，填料会吸附杂质导致柱效下降。正确做法是：反相柱用高比例有机相（如80%乙腈）冲洗再生，离子交换柱用高盐溶液洗脱结合物。保存时，反相柱应储存于纯有机溶剂（如甲醇）中，离子交换柱则保存在20%乙醇中。
误区二：样品过载
上样量超过柱容量会导致峰形展宽和分离度下降。建议初次实验时保守上样，根据分离效果逐步增加。分析型柱的上样量通常在微克级，制备型柱可根据厂商推荐按比例放大。
误区三：pH与缓冲液选择不当
离子交换色谱中，缓冲液pH应确保多肽和目标杂质带相反电荷。常见错误是忽略多肽等电点，导致结合效率低下。务必计算或测定多肽的等电点，并将pH控制在适当范围（通常距pI1-2个单位）。
误区四：忽视系统适应性
每次纯化前应进行系统适应性测试，包括柱效、不对称度和保留时间重复性。使用标准多肽混合物（如市售多肽标准品）评估柱状态，避免使用性能下降的柱子进行关键实验。
误区五：纯化后处理不当
收集的组分应立即处理或冷冻干燥，避免反复冻融或长时间置于酸性/有机溶剂中导致降解。对于反相纯化的多肽，需注意去除TFA等离子对试剂，特别是在后续生物活性实验中。
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